技術(shù)講堂—抗體相關(guān)知識（1）

技術(shù)講堂—抗體相關(guān)知識（1）

抗體(antibody)是生物體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白(Ig)。按抗體的來源，可將其分為天然抗體和人工制備的抗體，是通過對特定生物體免疫接種特定抗原物質(zhì)后而獲得。人工免疫動物制備的抗體應(yīng)用甚為廣泛，既可以用于科學(xué)研究，也可以用于疾病的預(yù)防、診斷和治療。

一、抗體的基本結(jié)構(gòu)
經(jīng)x線晶體衍射結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，抗體Ig由四條多肽鏈組成，各肽鏈之間由數(shù)量不等的鏈間二硫鍵連接。Ig可形成“Y”字型結(jié)構(gòu)，稱為Ig單體，是構(gòu)成抗體的基本單位。
（一）重鏈和輕鏈

天然Ig分子含有四條異源性多肽鏈，其中，分子量較大的兩條鏈稱為重鏈(heavy chain, H)，而分子量較小的兩條鏈稱為輕鏈(Light chain, L)。同一Ig分子中的兩條H鏈和兩條L鏈的氨基酸組成*相同。
1. 重鏈分子量為50000～75000，由450～550個(gè)氨基酸殘基組成。重鏈恒定區(qū)的氨基酸組成和排列順序不同，其抗原性也不同。據(jù)此，可將抗體Ig分為5類(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE, 其相應(yīng)的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈，商品化的抗體絕大部分都是IgG。不同類的Ig具有不同的特征，如鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的數(shù)量和位置、結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鉸鏈區(qū)的長度等均不*相同。即使是同一類的Ig，其鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)量、位置也不同，據(jù)此又可將同類Ig分為不同的亞類(subclass)。
IgG的亞類
利用不同種屬動物制備的IgG存在不同的亞類，常見的不同種屬IgG亞類如下：
• 兔: IgG（無亞類）
• 小鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3
• 大鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgM
• 山羊: IgG1, IgG2
在進(jìn)行某些抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)(如IF和FCM)的時(shí)候，我們常常需要仔細(xì)看一下所訂購商品化抗體的IgG亞類，以方便我們選擇同型對照(isotype control) IgG (即與目的蛋白抗體相同來源種屬的相同類型正常IgG)作為抗體的陰性對照進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，以排除可能的非特異性染色結(jié)果。
2. 輕鏈分子量約為25000，由214個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。輕鏈可分為兩種，分別為kappa(κ)鏈和lambda(λ)鏈。據(jù)此，可將lg分為兩型(type)，即κ型和λ型，一個(gè)Ig分子上兩條輕鏈的型別總是相同的。生物體內(nèi)可同時(shí)存在κ型和λ型的Ig分子，不同種屬生物體內(nèi)兩型輕鏈的比例不同。正常人血清Ig的κ: λ約為2:1，而在小鼠則為20:1。根據(jù)λ鏈恒定區(qū)個(gè)別氨基酸的差異，又可將λ鏈分為λl、λ2、λ3和λ4四個(gè)亞型(subtype)。

（二）可變區(qū)和恒定區(qū)
通過分析不同Ig重鏈和輕鏈的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，重鏈和輕鏈靠近N端的約110個(gè)氨基酸序列變化很大，其他部分氨基酸序列相對恒定。因此，將Ig輕鏈和重鏈中靠近N端氨基酸序列變化較大的區(qū)域稱為可變區(qū)(variable region, V區(qū))，占重鏈1/4，占輕鏈1/2；將靠近C端的氨基酸序列相對穩(wěn)定的區(qū)域，稱為恒定區(qū)(constant region, C區(qū))，占重鏈3/4，占輕鏈1/2。
1．可變區(qū) 重鏈和輕鏈的V區(qū)分別稱為VH和VL。VH和VL中各含有3個(gè)氨基酸組成和排列順序高度可變的區(qū)域，稱為高變區(qū)(hypervariable region, HVR)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region, CDR), 包括HVR1(CDR1)、HVR2(CDR2) 和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)變化程度更高。VH的3個(gè)高變區(qū)分別位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3個(gè)高變區(qū)分別位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3個(gè)CDR共同組成Ig的抗原結(jié)合部位(antigen binding site)，決定抗體的特異性，是抗體識別及結(jié)合抗原的部位。
2．恒定區(qū) 重鏈和輕鏈的C區(qū)分別稱為CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL長度基本一致，但是不同類Ig的CH長度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3, 而IgM和IgE則包括CHl、CH2、CH3和CH4。

（三）鉸鏈區(qū)
鉸鏈區(qū)(hinge region)位于CH1與CH2之間，富含脯氨酸，易伸展彎曲，從而改變抗原結(jié)合部位之間的距離，有利于抗體結(jié)合位于不同位置的抗原表位。鉸鏈區(qū)易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，產(chǎn)生不同的水解片段。

抗體的純化
我們知道，一般免疫血清中含有特異性抗體和非特異性抗體，血清蛋白以及其他各種雜蛋白等，在制備特異性抗體過程中當(dāng)抗體的效價(jià)達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期之后，需要對免疫血清進(jìn)行純化提取得到效價(jià)更高，特異性更強(qiáng)，穩(wěn)定性更好的抗體。
目前，大多數(shù)商品化抗體使用Protein A或Protein G進(jìn)行純化。由于protein A或protein G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合。Protein A或protein G 作為配基可以被偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，當(dāng)抗血清從中流過時(shí)，特異性的IgG就與配基結(jié)合，其他雜蛋白則穿流而過。因兩種蛋白純化抗體時(shí)對不同宿主的抗體的結(jié)合能力不同，我們需要具體情況，分別選擇protein A 或protein G, 或者是protein A/protein G組合。一般兔抗（包括單克隆蛋白與多克隆抗體）、小鼠單抗IgG2a、IgG2b、IgG3, 選擇用protein A純化；而小鼠、大鼠和山羊的多克隆抗體、小鼠單抗IgG1、大鼠單抗，則選擇用protein G純化。