多重熒光探針PCR檢測試劑盒的使用方法

1.1樣本前處理

每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；棉拭子直接取100μL提取。

1.2RNA提取

推薦采用RNA提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑AIV-H7N9 反應液 酶液

用量20μL 1μL

將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區）

將步驟1提取的RNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR擴增（核酸擴增區）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM、CY5，淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。

4.3推薦循環參數設置：

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1cycle 95℃ 10min 否

3 40cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop 值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2結果判斷

FAM通道為禽流感病毒H7N9亞型H7基因檢測結果，CY5通道為禽流感病毒

H7N9亞型N9基因檢測結果

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。

可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現Ct值≤35.0和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

6.檢測方法的局限性

樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定

量檢測不準確的結果；

本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質控標準

陰性質控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。