霍亂弧菌O139(VC O139)核酸檢測試劑盒的操作使用

霍亂弧菌O139(VC O139)核酸檢測試劑盒適用于ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
1、試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿10份，多配制 1份），每測試反應體系配制如下表：將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

2、加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
3、 PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
3.1  將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；
3.2  設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。
3.3  推薦循環(huán)參數(shù)設置：

4、結果分析判定
4.1  結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié)Baseline的start值（一般可在3~15范圍內調節(jié)）、stop值（一般可在5~20范圍內調節(jié)），以及Threshold的Value值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。
4.2  結果判斷
陽性：檢測通道Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道35值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為35值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；陰性：樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值。
5、質控標準
陰性質控品：Ct>38 或無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。