偽狂犬病毒通用型（PRV-gB）熒光PCR試劑盒針對偽狂犬病毒gB基因高度保守區(qū)基因序列設計特異性引物和熒光探針[3]。在反應體系中含偽狂犬病毒gB基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放 熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性、定量分析。

偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Pseudorabies Virus gB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型、傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒[1]。豬是偽狂犬病的自然宿主，對其危害大。可致妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎及胎兒干尸化。對初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)運動失調，麻痹，衰竭死亡，病死率 100%。成年豬多呈隱性感染，但可引起呼吸道癥狀[2]。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源，病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的帶毒豬可持續(xù)排毒一年。

本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測偽狂犬病毒，對偽狂犬病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對偽狂犬病毒gB基因高度保守區(qū)基因序列設計特異性引物和熒光探針[3]。在反應體系中含偽狂犬病毒gB基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放   熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性、定量分析。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

核酸提取液 1.5mL×2 管

酶液 50μL×1 管

PRV-gB 反應液 1.0mL×1 管

PRV-gB 陽性質控品 50μL ×1 管

陰性質控品 250μL ×1 管

注：

1）丌同批號試劑丌能混用。

2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)丌超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺的豬，取腦、淋巴結、脾臟、肺臟等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5mL。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但丌能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個丌同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取

0. 5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提取；血液取血清 100μL 提取。

1.2DNA 提取

1)對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000

rpm 離心 5min，取上清液轉移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2)DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒

（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣本總數(shù)每滿 7 份，則多配制 1 頭份 PCR 反應液)，單個測試反應液體系配制如下表：

試劑 PRV-gB 反應液 酶液

用量（樣本數(shù)為 N） 20μL 1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3.

加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內調節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴增曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，丏出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。

6.質控標準

陰性對照：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性對照：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

Ø樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

Ø樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

Ø陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

Ø病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

Ø丌同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

Ø試劑運輸，保存丌當或試劑配制丌準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測丌準確的結果；

【注意事項】

Ø所有操作嚴格按照說明書進行；

Ø試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø反應液應避光保存；

Ø反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

Ø樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

Ø實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

Ø試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]婁高明，杜偉賢．偽狂犬病流行概況及豬場防制策略[Ｊ]．中國動物檢疫，1999， 16（5）：43－45.

[2]殷震，劉景華．動物病毒學[Ｍ]．北京：科學出版社，1997.

[3]朱淑芬,朱瑞良,喬彩霞.檢測偽狂犬病毒ｇＢ基因熒光定量ＰＣＲ方法的建立[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32（10）:1413-1417.

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