禽流感是由A型流感病毒所引起的禽類疾病。H5/H7除了感染禽類外，部分亞型也能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對(duì)其不致病，當(dāng)它們傳染給其它物種時(shí)有時(shí)會(huì)造成大的發(fā)病率和死亡率。
豬藍(lán)耳高致病PRRSV-UPRRSV-M熒光PCR試劑盒分別對(duì)PRRSV-UPRRSV-M設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì) RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)。

豬藍(lán)耳高致病PRRSV-UPRRSV-M熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬藍(lán)耳病病毒通用型/高致病性豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV-U/PRRSV-M)核酸檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光-PCR法)

Name ：RSV universal / highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV-U/PRRSV-M) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence -PCR)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

豬藍(lán)耳病病毒通用型/高致病性豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV-U/PRRSV-M)感染引起的豬急性、熱性、高度接觸性傳染病。其特征為高熱，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血，死亡率高。家養(yǎng)豬和野豬都可以被感染，而且不分品種和年齡。

本試劑盒適用于檢測(cè)分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等樣本中的豬藍(lán)耳病病毒通用型/高致病性豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV-U/PRRSV-M)，用于豬藍(lán)耳病病毒通用型/高致病性豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV-U/PRRSV-M)感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒根據(jù)豬藍(lán)耳病病毒通用型/高致病性豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV-U/PRRSV-M)基因組設(shè)計(jì)特異性引物和探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

核酸提取液 1.5mL×2 管

酶液 50μL×1 管

ASFV 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

ASFV 陽性質(zhì)控品 50μL×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL×1 管

注：

1）不同批號(hào)試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺豬，取分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取

0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2DNA 提取

1)對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000

rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2)DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒

（離心柱提取法），請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 ASFV 反應(yīng)液 酶液

用量（樣本數(shù)為 N） 20μL 1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線。

可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

6.檢測(cè)方法的局限性

樣本檢測(cè)結(jié)果不樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

【注意事項(xiàng)】

所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻幵短暫離心；

反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，幵按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1559-2010 非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范[S].

[2]黃萍, 肖家勇, 歐陽振宇. 非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)方法的建立[S]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2010.

[3]董志珍, 侯艷梅, 趙祥平. 非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)方法的建立[S]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2009.

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